4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методика измерений массовой доли
синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5
(тадалафила, варденафила и силденафила)
в биологически активных добавках
методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии с ультрафиолетовым и
масс-спектрометрическим детектированием

Методические указания
МУК 4.1.3331-16

Москва 2016

1. Разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, В.В. Бессонов, И.Б. Перова, А.А. Жогова, A.П. Воробьев) и ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (С.В. Орлова, О.Г. Потанина, С.В. Горяинов, Е.А. Никитина, B.А. Ивлев, Г.А. Калабин).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 февраля 2016 г.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методика измерений массовой доли синтетических
ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила,
варденафила и силденафила) в биологически активных
добавках методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии с ультрафиолетовым и
масс-спектрометрическим детектированием

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями (центрами), осуществляющими контроль качества и безопасности биологически активных добавок к пище, аккредитованными в соответствии с требованиями Федерального закона от 28.12.2013 № 412-ФЗ «Об аккредитации в национальной системе аккредитации».

1.2. Настоящие МУК распространяются на исследования недекларированного добавления синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в некоторых биологически активных добавках к пище и носят рекомендательный характер.

2. Общие положения

Настоящие МУК устанавливают порядок определения синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в биологически активных добавках к пище (далее - БАД) к пище методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 0,2 до 50 мг/г.

3. Краткая характеристика тадалафила,
силденафила и варденафила

Общепринятые названия:

Тадалафил CAS №: 171596-29-5;

Силденафила цитрат СAS №: 171599-83-0;

Варденафила гидрохлорид CAS №: 330808-88-3.

Химические названия и структурные формулы веществ:

1. Тадалафил - (6R,12аR)-6-(1,3-Бензодиоксол-5-ил)-2-метил-2,3,6,7,12,-12а-гексагидро-2-метилпиразино[1',2':1,6]пиридо[3,4-b]индол-1,4-дион.

Структурная формула (рис. 1);

2. Силденафил - (1-[[3-(6,7-Дигидро-1-метил-7-оксо-3-пропил-1Н-пиразоло[4,3-альфа]пиримидин-5-ил)-4-этоксифенил]сульфонил]пиперазин (в форме цитрата).

Структурная формула (рис. 2);

3. Варденафил - 1-[[3-(1,4-Дигидро-5-метил-4-оксо-7-пропилими-дазо[5,1-f][1,2,4]триазин-2-ил)-4-этоксифенил]сульфонил]-4-этилпиперазин (в форме моногидрохлорида).

Структурная формула (рис. 3).

Тадалафил, силденафил, варденафил - фармацевтические препараты, предназначенные для лечения эректильной дисфункции и являющиеся селективными ингибиторами специфической фосфодиэстеразы типа 5 (ФДЭ5) циклического гуанозин монофосфата (цГМФ).

Данные фармацевтические препараты рекомендуется применять по назначению врача после сбора полного анамнеза и проведения тщательного урологического и общеклинического обследования, особенно у больных с сопутствующими сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также для исключения взаимодействия с другими принимаемыми пациентом фармацевтическими препаратами (в частности, органическими нитратами).

Существует проблема фальсификации, связанная с возможным недекларированным присутствием тадалафила, силденафила и варденафила в некоторых БАД.

Рис. 1. Структурная формула тадалафила

Рис. 2. Структурная формула силденафила

Рис. 3. Структурная формула варденафила

Физические свойства: тадалафил, силденафил и варденафил представляют собой белые кристаллические порошки с температурой плавления 276 - 279 °С, 185 - 187 °С и 191 - 193 °С соответственно. Тадалафил, силденафил и варденафил хорошо растворяются в метаноле.

УФ-спектр тадалафила в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 284 и 291 нм. Спектр метанольного раствора стандарта тадалафила приведен на рис. 4. Молекулярная масса тадалафила 389,4 г/моль молярная экстинция при максимуме поглощения ε = 16500 л × моль^-1 × см^-1.

Рис. 4. УФ-спектр раствора тадалафила в метаноле с концентрацией 16,0 мкг/мл

УФ-спектр силденафила (в форме цитрата) в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 292 нм. Спектр метанольного раствора стандарта силденафила приведен на рис. 5. Молекулярная масса силденафила 474,6 г/моль (силденафила цитрата 666,7 г/моль), молярная экстинкция при максимуме поглощения ε = 13800 л × моль^-1 × см^-1.

Рис. 5. УФ-спектр раствора силденафила в метаноле с концентрацией 14,7 мкг/мл

УФ-спектр варденафила (в форме гидрохлорида) в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 242 нм. Спектр метанольного раствора стандарта варденафила приведен на рис. 6. Молекулярная масса варденафила 488,6 г/моль (варденафила гидрохлорида 524,1 г/моль), молярная экстинкция при длине волны λ = 285 нм ε = 8610 л × моль^-1 × см^-1.

Рис. 6. УФ-спектр раствора варденафила в метаноле с концентрацией 16,0 мкг/мл

4. Определение тадалафила, силденафила и варденафила
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
с УФ-спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим
детектированием

4.1. Основные положения

4.1.1. Принцип метода.

Методика основана на определении тадалафила (далее - ТДЛ), силденафила (далее - СЛД) и варденафила (далее - ВРД) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором с подтверждением структуры с помощью масс-селективного детектора.

4.1.2. Метрологические характеристики метода для указанного диапазона концентраций тадалафила, силденафила и варденафила в пробе приведены в табл. 1.

Таблица 1

4.2. Реактивы

Тадалафил (стандарт, не менее 99 %)

Силденафила цитрат (стандарт, не менее 98 %)

Варденафила гидрохлорид (стандарт, не менее 90 %)

Метанол для ВЭЖХ

Ацетонитрил для ВЭЖХ

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Раствор формиата аммония 5М или формиат - аммония квалификации ХЧ

4.3. Средства измерений, испытательное оборудование и
лабораторная посуда

4.4. Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

4.5. Подготовка к определению

4.5.1. Приготовление раствора стандарта тадалафила

Навеску тадалафила (20 ± 1) мг (здесь и далее: точная навеска) помещают в мерную колбу на 100 см³, добавляют 70 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 200 мкг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °С в течение 6 месяцев.

4.5.2. Приготовление рабочего раствора стандарта тадалафила
с концентрацией 20 мкг/см³ (срок хранения 14 дней)

Мерной пипеткой переносят 5 см³ раствора хранения стандарта тадалафила в мерную колбу на 50 см³, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °С в течение не более 2 недель. Концентрацию рабочего раствора подтверждают с помощью УФ-спектрофотометрии, используя коэффициент молярной экстинкции при λ = 284 нм:

D - оптическая плотность раствора; ε - коэффициент молярной экстинкции тадалафила (16500 л × моль^-1 × см^-1).

Пересчет на концентрацию С в мг/л проводится по формуле:

4.5.3. Приготовление раствора стандарта силденафила

Навеску силденафила цитрата (28 ± 1) мг (соответствует 20 мг силденафила) помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 30 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 400 мкг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °С в течение не более 6 месяцев.

4.5.4. Приготовление рабочего раствора стандарта силденафила
с концентрацией 40 мкг/см³ (срок хранения 14 дней)

Мерной пипеткой переносят 5 см³ раствора хранения стандарта силденафила в мерную колбу на 50 см³, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °С в течение не более 2 недель. Концентрацию рабочего раствора подтверждают с помощью УФ-спектрофотометрии, используя коэффициент молярной экстинкции при λ = 292 нм.

Расчет концентрации рабочего раствора проводят аналогично п. 4.5.2.

При величине коэффициента молярной экстинкции для силденафила ε = 13800 л × моль^-1 × см^-1 и молекулярной массе 474,6 г/моль концентрация рабочего раствора равна:

4.5.5. Приготовление стандартного раствора варденафила

Навеску варденафила гидрохлорида (24 ± 1) мг (соответствует 20 мг варденафила) помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 30 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 400 мкг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °С в течение не более 6 месяцев.

4.5.6. Приготовление рабочего раствора стандарта варденафила
с концентрацией 40 мкг/см³ (срок хранения 14 дней)

Мерной пипеткой переносят 5 см³ раствора хранения стандарта варденафила в мерную колбу на 50 см³, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °С в течение не более 2 недель.

Расчет концентрации рабочего раствора проводят аналогично п. 4.5.2.

При величине коэффициента молярной экстинкции для варденафила ε = 8610 л × моль^-1 × см^-1 и молекулярной массе 488,6 г/моль концентрация рабочего раствора равна:

4.5.7. Приготовление подвижной фазы

Для приготовления раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см³ отмеривают 400 см³ воды дистиллированной и, тщательно перемешивая, прибавляют 1,0 см³ 5М раствора формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см³, доводят водой дистиллированной до метки и перемешивают.

При использовании формиата аммония квалификации ХЧ навеску массой 630 мг переносят в мерную колбу объемом 1000 см³, доводят водой дистиллированной до метки и тщательно перемешивают до полного растворения навески.

Для приготовления подвижной фазы в мерную колбу объемом 1000 см³ отмеривают 400 см³ раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль и, тщательно перемешивая, добавляют 600 см³ ацетонитрила до метки. Подвижную фазу фильтруют под вакуумом с применением мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 μм.

Примечание. При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

4.5.8. Подготовка образца к анализу

При анализе БАД таблетированные формы (5 таблеток) подвергают измельчению, в случае капсулированных препаратов содержимое 5 капсул извлекают из оболочки (при необходимости оболочки капсул измельчают и добавляют к содержимому капсул). Таким же способом можно подвергнуть анализу сырье для производства БАД или оболочки капсул (5 - 10 капсул). На анализ берется навеска усредненного образца, соответствующая массе 1,0 г. После взвешивания навеску пробы помещают в мерную колбу на 100 см³, добавляют 100 см³ смеси метанол:вода (6:4, v:v) (объем V). Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 20 мин. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 10000. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

Примечание. В случае высоких концентраций ингибиторов ФДЭ-5 («зашкаливание» на хроматограмме) из объема V (100 см³) отбирают аликвоту в 10 см³ и разбавляют смесью метанол:вода (6:4, v:v) в N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации (п. 4.7).

4.6. Обнаружение и количественное определение

4.6.1. Условия проведения ВЭЖХ

Условия проведения ВЭЖХ приведены в табл. 2.

Таблица 2

4.6.2. Условия детектирования на времяпролетном
масс-спектрометрическом детекторе

Условия детектирования на времяпролетном масс-спектрометрическом детекторе приведены в табл. 3.

Таблица 3

4.6.3. Условия детектирования на тройном квадрупольном
масс-спектрометрическом детекторе

Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе приведены в табл. 4.

Таблица 4

4.6.4. Идентификация ТДЛ, СЛД и ВРД

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами (характеристичными «переходами») соответствующих стандартов. Типичные хроматограммы и масс-спектры приведены на рис. 7 - 11.

Рис. 7. УФ-хроматограмма смеси стандартов тадалафила, варденафила и силденафила,
λ = 292,8 нм (колонка Protecol HPH125-C18, 250×4,6 мм,
размер частиц 5 мкм)

Рис. 8. Хроматограмма выделенных ионов тадалафила m/z 390.1423, варденафила
m/z 489.2241 и силденафила m/z 475.2085 (колонка Protecol НРН125-С18, 250×4,6 мм,
размер частиц 5 мкм)

Рис. 9. Масс-спектр ионизации электрораспылением тадалафила

Рис. 10. Масс-спектр ионизации электрораспылением верденафила

Рис. 11. Масс-спектр ионизации электрораспылением силденафила

Рис. 12. Спектр МС/МС [М + Н]⁺ тадалафила

Рис. 13. Спектр МС/МС [М + Н]⁺ варденафила

Рис. 14. Спектр МС/МС [М + Н]⁺ силденафила

4.7. Обработка результатов измерения

Расчет содержания в образце ТДЛ, СЛД и ВРД проводят по формуле:

X - количество ТДЛ, СЛД или ВРД в образце, мг/г;

S_{ТДЛ(ВРД,СЛД)} - площадь ТДЛ, СЛД или ВРД в образце, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

S_стд - площадь стандарта ТЛД, СЛД или ВРД, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

V - объем раствора пробы, см³;

С - концентрация стандарта ТЛД, СЛД или ВРД, мг/см³;

m_{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г;

N - коэффициент разбавления пробы.

Результат анализа представляют в виде:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,2 мг/г».*

________

* - 0,2 мг/г - предел обнаружения.

4.8. Контроль результатов измерений

4.8.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Определение содержания тадалафила, силденафила и варденафила в каждом образце проводится в 2 параллельных измерениях. Вывод о допустимости расхождения между параллельными измерениями определяют на основании предела повторяемости (r) по формуле:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/г.

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r) измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

4.8.2. Проверка лабораторной воспроизводимости

Вывод о допустимости расхождения между разными лабораторными измерениями одной и той же пробы определяют на основании предела воспроизводимости (R) по формуле:

X₁, Х₂ - результаты разных лабораторных определений, мг/г.

При превышении расчетного значения предела воспроизводимости (R) измерение следует провести заново, используя новую пробу.

4.8.3. Оперативный контроль проведения измерения
с использованием метода добавок

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы БАД к пище (содержащие тадалафил (силденафил или варденафил) в концентрации не менее нижнего предела количественного определения. Пробу разделяют на две равные части. Одну оставляют без изменений, а к другой добавляют стандартный раствор тадалафила (силденафила или варденафила) в таком количестве, чтобы его массовая доля увеличилась на 50 - 100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы и пробы с добавкой.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (Сʹ_рк), пробы без добавки (С_рк) и величиной добавки (С_добрк) с нормативом оперативного контроля (K). Норматив оперативного контроля (K) рассчитывают по формуле:

Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия:

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

5. Интерпретация результатов анализа

Метод ВЭЖХ-УФ-спектрофотометрии предоставляет необходимый предел обнаружения и достаточную селективность анализа. При получении отрицательных результатов ВЭЖХ-УФ-анализа образец рассматривается как свободный от наличия остатков тадалафила, силденафила или варденафила.

При положительных результатах ВЭЖХ-УФ-анализа необходимо обязательное подтверждение наличия тадалафила, силденафила или варденафила с помощью ВЭЖХ-масс-спектрометрии.

6. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и навыками в области хромагомасс-спектрометрии.

7. Требования охраны труда

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования охраны труда при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.4.103-83.

Помещение, в котором проводят анализы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021-75.

Электробезопасность при работе с электроустановками - по ГОСТ 12.2.007.0-75 и по ГОСТ Р 12.1.019-2009.

Организация обучения работающих безопасности труда - по постановлению Минтруда РФ и Минобразования РФ от 13 января 2003 г. № 1/29 «Об утверждении Порядка обучения по охране труда и проверки знаний требований охраны труда работников организаций».

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по постановлению Правительства РФ от 25 апреля 2012 г. № 390 «О противопожарном режиме» и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005-88.

8. Условия проведения измерений

Условия измерений (температура, влажность, напряжение сети, атмосферное давление и пр.) должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование, материалы и реактивы.

9. Список использованной литературы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. СП 1.1.1058-01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

3. СП 1.1.2193-07 «Изменения и дополнения к СП 1.1.1058-01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

4. СанПиН 2.3.2.1290-03 «Гигиенические требования к организации производства и оборота биологически активных добавок к пище (БАД)».

5. ГОСТ Р 8.563-2009 ГСИ. Методики (методы) измерений.

6. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения.

7. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.

8. ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений.

9. Tadalafil (англ.). Drugs.com.

10. Тадалафил. Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента. РЛС Патент. Инструкция, применение и формула.

11. Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil - Labels updated with NAION information. FDA Statement. United States Food and Drug Administration, 8 July 2005 (англ.). WHO Pharmaceuticals Newsletter 2005, No. 03.