Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации
Государственные санитарно-эпидемиологические правила и нормативы
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В 99 - продуцента витамина В12
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1008-00
Минздрав России
Москва 2001
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина B12 в воздухе рабочей зоны: Методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001.
1. Разработаны канд. биол. наук Бару Р.В., канд. биол. наук Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21 декабря 2000 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации - Первый заместитель
Министра здравоохранения Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
21 декабря 2000 г.
Дата введения: с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Pseudomonas fluorescens
(denitrificans)
В99 - продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1008-00
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99 - продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
2. Характеристика штамма-продуцента витамина В12
Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99 является продуцентом витамина В12. Штамм растет на агаризованных средах на основе мелассы при температуре 28°С. В течение 3-х суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45 - 0,85´0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл/м3.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В12 на поверхность плотной питательной среды и подсчете высохших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) |
ТУ 64-12791-77 |
Термостаты электрические суховоздушные или водяные |
ГОСТ 9586-75 |
Автоклав электрический |
|
Бокс, оборудованный бактериальными лампами |
|
Холодильник бытовой |
|
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 |
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 |
|
Лупа увеличением ´10 |
ГОСТ 25706-83 |
Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм |
|
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл |
ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл |
ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1, 5, и 10 мл |
ГОСТ 1770-74 |
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл |
ГОСТ 1770-74 |
Секундомер |
ГОСТ 9586-75 |
Барометр |
ГОСТ 24696-79 |
Марля медицинская |
ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая |
ГОСТ 25556-81 |
Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента.
Среда: меласса - 100 - 150 г; (NН4)2НРО4 - 1,3 г; MgSО47H2О - 1,0 г; (NН4)2SО4 - 0,5 г; MnSO4H2O - 0,1 г; ZnSO47H2O - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация 121°С, 30 минут.
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкция по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическими материалами осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20±5°С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента витамина B12 в воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
Метод предлагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60°С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицитин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28°С. Через 48 - 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентраций клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле
, кл/м3,
где Х - количество микробных клеток в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент перевода на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с полной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе).
При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента: эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см2.
Составляем пропорцию:
на 100 см2 за 1 мин оседает 2 л воздуха
на 78,54 см2 - Х л
Х= 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 м3 воздуха.
На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57×Т, л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3 воздуха содержится
.
Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха содержится
клетки.
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans) B99 в воздухе рабочей зоны.
1. Дата проведения анализа _________________________
2. Место отбора пробы _____________________________
3. Название лаборатории ___________________________
4. Юридический адрес организации __________________
Результаты микробиологического анализа
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл/м3 |
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. - 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. - 7 с.